Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте

Актуальность. На сегодняшний день традиционные методики ле­чения тяжелых форм возрастной макулярной дегенерации (ВМД) не всегда позволяют добиться значимого улучшения зрения.

Новым перспективным методом лечения ВМД является трансплан­тация ретинального пигментного эпителия (РПЭ).

По нашему мнению, наиболее современной формой транспланта­та РПЭ является многоклеточный сфероид - это форма 3D-клеточной культуры, в которой клетки приближены к условиям нативной ткани.

Однако трансплантация РПЭ в форме 3D-сфероидов требует про­ведения доклинических исследований.

Цель. Разработать технику трансплантации 3D-сфероидов РПЭ на глазах экспериментальных животных (кролики).

Материал и методы. 1. Этап исследований in vitro. Для иммуно­цитохимического исследования полученные 3D-культуры сфероидов изучали на 3-е, 7-е и 11-е сутки сфероидогенеза (лазерный сканиру­ющий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония). Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров (Alexa Fluor, Великобритания), таких как: RPE-65, ZO-1, Цитокератин 8, 18, а также мезенхимального маркера Виментина.

2. Этап исследований in vivo. Всем кроликам (n=10) выполняли ви­трэктомию (2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт.ст.), (Alcon, Accurus, США). Далее острой канюлей 39G делали ретинотомическое отвер­стие выше места центральной зоны сетчатки и субретинально вводи­ли сфероиды РПЭ (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). Опера­ции заканчивались заменой жидкости на воздух и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.

Методы послеоперационного контроля: ультразвуковое В-скани- рование глаза (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическая ко­герентная томография (ОКТ), (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Германия).

Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеиро­вались для последующего гистологического исследования.

Результаты. 1. Этап исследований in vitro. При проведении имму­ноцитохимического окрашивания полученных 3D-культур отмечалось наличие ярко выраженной экспрессии характерного высокоспеци­фичного маркера пигментного эпителия сетчатки RPE-65, а также эпи­телиальных маркеров Цитокератина 8, 18 и ZO-1. Экспрессия мезен­химального маркера Виментина была слабой, что свидетельствует о преимуществе 3D-культивирования эпителиальных клеток для сохра­нения их эпителиального фенотипа.

2. Этап исследований in vivo. При проведении ультразвукового В-сканирования в 1 сутки у 6 кроликов отмечалась плоская отслой­ка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у 4 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не визуализировалась.

ОКТ-картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных - в течение первых 7 суток по­сле хирургии в зоне оперативного вмешательства отмечался кистоз­ный отек и плоская отслойка сетчатки. По мере наблюдения сетчат­ка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также на 3, 7 и 10 сутки субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм - предположительно 3D-сфероиды РПЭ. При прове­дении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологическо­го состояния сетчатки не наблюдалось.

По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распласты­ванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.

Выводы. 1. Предложенная технология культивирования кроли­чьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позво­ляет сохранить эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается данными иммуноцитохимических исследований.

1. Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ яв­ляется приемлемой, что подтверждается данными оптической коге­рентной томографии и гистологическими исследованиями.
2. Предложенная хирургическая техника субретинальной транс­плантации 3D-сфероидов РПЭ является перспективной для дальней­ших экспериментальных исследований с целью внедрения в клини­ческую практику.

1. Yannuzzi L.A., Friedman R., Fine S.L. et al. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988;64(9): 955-1013.

2. Либман Е.С., Шахова Е.В. Слепота, слабови- дение и инвалидность по зрению в Российской Фе-дерации. Российский межрегиональный симпозиум «Ликвидация устранимой слепоты: Всемирная ини-циатива ВОЗ». Материалы. М.; 2003: 38-42.

3. Балашова Л.М. Витаминно-минеральные комплексы и здоровье глаз. Русский медицинский журнал. Клиническая офтальмология. 2008;9(1): 41- 45.

4. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003;110(5): 979-986. Available from: https://doi. org/10.1016/S0161-6420(03)00085-X.

5. Бикбов М.М., Файзрахманов Р.Р. Оператив¬ное лечение пациентов с фиброваскулярными мем¬бранами при макулярной дегенерации с частич¬ным восстановлением пигментного эпителия сет¬чатки. Современные технологии в офтальмоло¬гии. 2017;1: 35-38.

6. Schmidt-Erfurth U., Hasan T., Gragoudas E. et al. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994;101(12): 1953¬1961.

7. Binder S., Stolba U., Krebs I. et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 2002;133(2): 215-225.

8. Falkner-Radler C.I., Krebs I., Glittenberg K. et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011;95: 370-375. Available from: https://doi.org/10.1136/bjo.2009.176305.

9. Bindewald A., Roth F., Van Meurs J., Holz F.G. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004;101(9): 886-894. Available from: https://doi. org/10.1007/s00347-004-1077-2.

10. Zhao C., Boles N.C., Miller J.D. et al. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J. Visualized Experiments. 126:e55220. Available from: https://doi. org/10.3791/55220.

11. Борзенок С.А., Кошелева А.В., Попов И.А.. и др. 3D-культивирование ретинального пигментного эпителия трупных донорских глаз человека на предтрансплантационном этапе. VII Всероссийский съезд трансплантологов. Материалы съезда. М.; 2014: 262-263.

12. Algvere P.V., Berglin L., Gouras P. et al. Transplantation of RPE in age-related macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1997;235(3): 149-158.

13. Del Priore L.V., Kaplan H.J., Tezel T.H. et al. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am. J. Ophthalmol. 2001;131(4): 472-480.

14. Nita M., Strzalka-Mrozik B., Grzybowski A. et al. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. MedSciMonit. 2012;18(6): RA97-103.

15. Binder S., Krebs I., Hilgers R.D. et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004;45(11): 4151-4160. Available from: https://doi.org/10.1167/iovs.04-0118.

16. Caramoy A., Liakopoulos S., Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011;89(8): 666-668. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1755-3768.2010.02018.x.

17. Van Meurs J.C., Averst E., Hofland L.J. et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br.J.Ophthalmol. 2004;88: 110-113.