Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте
Аннотация
Актуальность. На сегодняшний день традиционные методики лечения тяжелых форм возрастной макулярной дегенерации (ВМД) не всегда позволяют добиться значимого улучшения зрения.
Новым перспективным методом лечения ВМД является трансплантация ретинального пигментного эпителия (РПЭ).
По нашему мнению, наиболее современной формой трансплантата РПЭ является многоклеточный сфероид - это форма 3D-клеточной культуры, в которой клетки приближены к условиям нативной ткани.
Однако трансплантация РПЭ в форме 3D-сфероидов требует проведения доклинических исследований.
Цель. Разработать технику трансплантации 3D-сфероидов РПЭ на глазах экспериментальных животных (кролики).
Материал и методы. 1. Этап исследований in vitro. Для иммуноцитохимического исследования полученные 3D-культуры сфероидов изучали на 3-е, 7-е и 11-е сутки сфероидогенеза (лазерный сканирующий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония). Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров (Alexa Fluor, Великобритания), таких как: RPE-65, ZO-1, Цитокератин 8, 18, а также мезенхимального маркера Виментина.
2. Этап исследований in vivo. Всем кроликам (n=10) выполняли витрэктомию (2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт.ст.), (Alcon, Accurus, США). Далее острой канюлей 39G делали ретинотомическое отверстие выше места центральной зоны сетчатки и субретинально вводили сфероиды РПЭ (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). Операции заканчивались заменой жидкости на воздух и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Методы послеоперационного контроля: ультразвуковое В-скани- рование глаза (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическая когерентная томография (ОКТ), (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Германия).
Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировались для последующего гистологического исследования.
Результаты. 1. Этап исследований in vitro. При проведении иммуноцитохимического окрашивания полученных 3D-культур отмечалось наличие ярко выраженной экспрессии характерного высокоспецифичного маркера пигментного эпителия сетчатки RPE-65, а также эпителиальных маркеров Цитокератина 8, 18 и ZO-1. Экспрессия мезенхимального маркера Виментина была слабой, что свидетельствует о преимуществе 3D-культивирования эпителиальных клеток для сохранения их эпителиального фенотипа.
2. Этап исследований in vivo. При проведении ультразвукового В-сканирования в 1 сутки у 6 кроликов отмечалась плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у 4 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не визуализировалась.
ОКТ-картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных - в течение первых 7 суток после хирургии в зоне оперативного вмешательства отмечался кистозный отек и плоская отслойка сетчатки. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также на 3, 7 и 10 сутки субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм - предположительно 3D-сфероиды РПЭ. При проведении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологического состояния сетчатки не наблюдалось.
По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.
Выводы. 1. Предложенная технология культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позволяет сохранить эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается данными иммуноцитохимических исследований.
- Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ является приемлемой, что подтверждается данными оптической когерентной томографии и гистологическими исследованиями.
- Предложенная хирургическая техника субретинальной трансплантации 3D-сфероидов РПЭ является перспективной для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику.
Об авторах
С. А. БорзенокРоссия
Москва.
Е. И. Хаценко
Россия
Москва.
Д. С. Островский
Россия
Москва.
М. Х. Хубецова
Россия
Москва.
А. В. Шацких
Россия
Москва.
И. Г. Трифаненкова
Россия
Калуга.
М. А. Плахотний
Россия
Калуга.
Е. В. Ерохина
Россия
Калуга.
Список литературы
1. Yannuzzi L.A., Friedman R., Fine S.L. et al. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988;64(9): 955-1013.
2. Либман Е.С., Шахова Е.В. Слепота, слабови- дение и инвалидность по зрению в Российской Фе-дерации. Российский межрегиональный симпозиум «Ликвидация устранимой слепоты: Всемирная ини-циатива ВОЗ». Материалы. М.; 2003: 38-42.
3. Балашова Л.М. Витаминно-минеральные комплексы и здоровье глаз. Русский медицинский журнал. Клиническая офтальмология. 2008;9(1): 41- 45.
4. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003;110(5): 979-986. Available from: https://doi. org/10.1016/S0161-6420(03)00085-X.
5. Бикбов М.М., Файзрахманов Р.Р. Оператив¬ное лечение пациентов с фиброваскулярными мем¬бранами при макулярной дегенерации с частич¬ным восстановлением пигментного эпителия сет¬чатки. Современные технологии в офтальмоло¬гии. 2017;1: 35-38.
6. Schmidt-Erfurth U., Hasan T., Gragoudas E. et al. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994;101(12): 1953¬1961.
7. Binder S., Stolba U., Krebs I. et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 2002;133(2): 215-225.
8. Falkner-Radler C.I., Krebs I., Glittenberg K. et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011;95: 370-375. Available from: https://doi.org/10.1136/bjo.2009.176305.
9. Bindewald A., Roth F., Van Meurs J., Holz F.G. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004;101(9): 886-894. Available from: https://doi. org/10.1007/s00347-004-1077-2.
10. Zhao C., Boles N.C., Miller J.D. et al. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J. Visualized Experiments. 126:e55220. Available from: https://doi. org/10.3791/55220.
11. Борзенок С.А., Кошелева А.В., Попов И.А.. и др. 3D-культивирование ретинального пигментного эпителия трупных донорских глаз человека на предтрансплантационном этапе. VII Всероссийский съезд трансплантологов. Материалы съезда. М.; 2014: 262-263.
12. Algvere P.V., Berglin L., Gouras P. et al. Transplantation of RPE in age-related macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1997;235(3): 149-158.
13. Del Priore L.V., Kaplan H.J., Tezel T.H. et al. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am. J. Ophthalmol. 2001;131(4): 472-480.
14. Nita M., Strzalka-Mrozik B., Grzybowski A. et al. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. MedSciMonit. 2012;18(6): RA97-103.
15. Binder S., Krebs I., Hilgers R.D. et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004;45(11): 4151-4160. Available from: https://doi.org/10.1167/iovs.04-0118.
16. Caramoy A., Liakopoulos S., Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011;89(8): 666-668. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1755-3768.2010.02018.x.
17. Van Meurs J.C., Averst E., Hofland L.J. et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br.J.Ophthalmol. 2004;88: 110-113.
Для цитирования:
Борзенок С.А., Хаценко Е.И., Островский Д.С., Хубецова М.Х., Шацких А.В., Трифаненкова И.Г., Плахотний М.А., Ерохина Е.В. Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте. Офтальмохирургия. 2019;(1):27-32. https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-27-32
For citation:
Borzenok S.A., Khatsenko E.I., Ostrovkiy D.S., Khubetsova M.K., Shatskikh A.V., Trifanenkova I.G., Plakhotniy M.A., Erokhina E.V. The first experience of 3D spheroids retinal pigment epithelium transplantation in the experiment. Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery. 2019;(1):27-32. (In Russ.) https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-27-32